Itt szabadon szárnyalhatott fantáziája és elmerülhetett a tudományos kutatásokban: érdekelték a műszaki tudományok és azok katonai alkalmazásai, az építészet, a folyadékok mechanikája, a ballisztika, az optika és a statika. Arctanulmányokat készített, amelynek során komikus vagy bizarr, sokszor groteszk emberábrázolások születtek.
1498-ban fejezte be egyik leghíresebb képét a milánói Santa Maria delle Grazie-kolostor refektóriumának falán: Az utolsó vacsora azt a pillanatot örökíti meg, amikor Júdás árulására fény derül.
Donatello és Verocchio inspirálta a Francesco Sforza emlékére tervezett óriás bronz lovas szobrot, amelyet rá jellemző módon soha nem fejezett be. A terv 16 évig foglalkoztatta, az öntéshez 70 tonna fémet tettek félre, de csupán a terrakotta változatot alkotta meg, amelyet a Milánót lerohanó francia íjászok céltáblának használtak és leromboltak.
Leonardo ezután a köztársaság katonai tanácsadója lett, majd 1500-ban Cesare Borgia szolgálatába állt, akit minden útjára elkísért mérnökként és katonai építészként. Tökéletesítette a szárazföldi és a hajókra szerelhető fegyvereket, megnövelte a mozsárágyúk tűzerejét, új lövedékeket, gránátokat, ágyúkat tervezett. VIII. Károly francia király itáliai betörése után visszatért Firenzébe, ahol Michelangelóval közösen vállalta a Palazzo Vecchióban az anghirai csata dicsőséges pillanatait megörökítő monumentális kép megfestését.
1502-ben kezdte festeni és négy év múlva fejezte be a világ egyik leghíresebb képét, a Mona Lisát, amelynek talányos mosolyát könyvtárnyi könyv vizsgálja, de megfejteni senki sem tudta. A képet magával vitte Franciaországba, ahol a király megvette, ma a párizsi Louvre falán függ.
Életének hátralevő részét a nyugtalan vándorlás és egy utolsó nekilendülés jellemezte a tudomány, elsősorban az anatómiai kutatások területén. XII. Lajos francia király szolgálatába lépett, utolsó három évét magányban töltötte, csak tanítványa, Francesco Melzi maradt mellette, ő mentette meg műveit a pusztulástól.
A reneszánsz és talán minden idők legsokoldalúbb zsenije 1512. május 2-án halt meg Amboise-ban.
